Potente microscopio captura proteínas motoras con un detalle sin precedentes

Amanda Heidt es escritora y editora independiente en Moab, Utah.

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Ilustración de motores moleculares llamados cinesinas en un microtúbulo. Crédito: Graham Johnson, Ron Vale/HHMI

Casi tan pronto como hubo microscopios de súper resolución, los científicos los dirigieron hacia motores moleculares llamados cinesinas. Estas proteínas, impulsadas por el combustible molecular ATP, impulsan procesos cruciales que incluyen la división celular, la señalización celular y el transporte intracelular al transportar la carga a lo largo de las autopistas de proteínas llamadas microtúbulos. Los investigadores han querido durante mucho tiempo entender cómo funcionan estos motores, pero para visualizarlos, los científicos han tenido que reducir su velocidad o aislarlos en sistemas in vitro simplificados.

Ahora, en artículos publicados simultáneamente en Science, dos equipos que trabajan de forma independiente han utilizado una herramienta de súper resolución llamada MINFLUX para estudiar el motor casi en tiempo real en concentraciones fisiológicamente relevantes de ATP. El primer artículo, dirigido por el inventor de MINFLUX, Stefan Hell, quien tiene una cita conjunta en el Instituto Max Planck (MPI) para Ciencias Multidisciplinarias en Göttingen y el MPI para Investigación Médica en Heidelberg, ambos en Alemania, usó un nuevo diseño de instrumento para rastrear la proteína en 3D, revelando detalles sobre su movimiento1. El segundo, dirigido por el biofísico Jonas Ries del Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, mostró por primera vez que MINFLUX es capaz de rastrear la kinesina incluso en medio del bullicio de las células vivas2.

"Esta tecnología requiere muchas cosas diferentes para funcionar, y es divertido ver que todas estas cosas se unen", dice Michelle Digman, ingeniera biomédica de la Universidad de California, Irvine, que desarrolla estrategias de imágenes pero no participó en ninguna. estudiar. "Parecía una prueba de concepto para demostrar que pueden rastrear la kinesina con mucha precisión. Y cuando tienes el sistema de células vivas, eso es aún más espectacular".

Los investigadores comenzaron a trabajar en los conceptos básicos del movimiento de la kinesina poco después del descubrimiento de la proteína en 1985, pero la llegada de las herramientas de superresolución trajo un nuevo nivel de detalle. En 2004, los investigadores utilizaron una técnica llamada FIONA (imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro) para mostrar que la kinesina, que parece un tallo alto y retorcido con zapatos demasiado grandes, camina 'mano sobre mano' en su trayectoria de microtúbulos, moviendo su pies con un movimiento similar al de las manos de un niño mientras atraviesan un conjunto de barras trepadoras3. Pero, aunque FIONA proporcionó una resolución espacial excepcional, los científicos tuvieron que racionar el ATP para ralentizar la proteína lo suficiente como para estudiarla. En la última década, los investigadores etiquetaron la cinesina con perlas de germanio4 u oro5 para rastrearla, pero estas etiquetas relativamente voluminosas dejan dudas sobre qué tan bien los métodos recapitulan el rango completo de movimiento de la proteína.

Cuando Hell y su equipo introdujeron6 MINFLUX en 2016, lo vio como un avance sobre su predecesor, la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED), por la que Hell compartió el Premio Nobel de Química 2014. STED utiliza un láser de 'agotamiento' en forma de rosquilla superpuesto a un láser de excitación para reducir eficazmente el área de fluorescencia por debajo del límite de difracción convencional de la luz (alrededor de 250 nanómetros). MINFLUX, por el contrario, utiliza un láser en forma de rosquilla para crear un punto de intensidad de fluorescencia cero en su centro. Al mover este láser, los investigadores pueden señalar la ubicación de una molécula fluorescente a velocidades casi fisiológicas.

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En el nuevo estudio1, publicado en marzo, el grupo de Hell probó una versión de MINFLUX que pulsa láseres lineales en dos direcciones en el plano focal en rápida sucesión, localizando la proteína al encontrar dónde las intensidades de fluorescencia superpuestas son más bajas. Al combinar múltiples mediciones, los investigadores pudieron producir pistas que muestran dónde se mueve la molécula a lo largo del microtúbulo, como una aplicación que traza el camino de un corredor.

Aunque el nuevo MINFLUX no fue mucho más efectivo que la iteración anterior, dice Hell, su equipo pudo usarlo para deducir una velocidad de marcha para la kinesina de 550 nanómetros por segundo y una longitud de zancada de 16 nanómetros en concentraciones de ATP similares a las encuentra en las células vivas. Al etiquetar y rastrear diferentes partes de la proteína, el equipo también mostró que cada zancada comprende dos subpasos de 8 nanómetros y que el tallo de una kinesina gira a medida que se mueve, lo que resulta en un movimiento hacia adelante que gira ligeramente hacia la derecha. Los autores también encontraron que el ATP se absorbe cuando solo un pie está unido al microtúbulo, pero se consume cuando ambos pies están unidos, resolviendo hallazgos previamente contradictorios7,8.

Ries y su equipo abordaron la kinesin en movimiento desde una perspectiva diferente. Utilizaron un instrumento comercial MINFLUX desarrollado por Abberior, una empresa con sede en Göttingen cofundada por Hell, para rastrear la proteína en las células vivas. El entorno celular abarrotado y en constante cambio significó que el grupo terminó con menos pistas, pero pudieron capturar pasos laterales, estancamientos y saltos de un microtúbulo a otro: todos los esfuerzos de la proteína para sortear obstáculos que normalmente no son visto en muestras purificadas. "Por lo demás, vemos más o menos las mismas cosas: velocidades de caminata similares, los mismos tamaños de pasos", dice Ries. "Y fue agradable poder medirlos por primera vez en la célula viva".

William Hancock, ingeniero biomédico de la Universidad Estatal de Pensilvania en el State College que estudia la kinesina pero que no participó en ninguno de los estudios, llama a los estudios "bastante increíbles". Los resultados, señala, coinciden en gran medida con trabajos anteriores, casi todos los cuales se habían realizado in vitro utilizando proteínas motoras purificadas. "Obtenemos nuestras respuestas muy específicas allí, pero es bueno poder extrapolar al interior de las células. Es realmente un tour de force".

Dicho esto, está claro que MINFLUX "todavía no está en el límite de su rendimiento". Habiendo logrado una resolución espacial subnanométrica, un área en la que MINFLUX aún puede mejorar, dice, es en su desempeño temporal. Ambos grupos trabajaron con concentraciones de ATP de hasta un milimolar, pero la célula promedio contiene más de cuatro veces esa cantidad.

Lograr una resolución temporal en tiempo real bajo esas condiciones requerirá mejores sistemas de seguimiento, dice Luke Lavis, químico orgánico del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn, Virginia, quien desarrolló los tintes utilizados en el estudio de Ries. "Esta revolución en imágenes de superresolución pone de relieve, si puedo decirlo, el hecho de que muchas de las estrategias de etiquetado y fijación que hemos utilizado son grandes", dice. "El sueño de todos nosotros es poder unir un fluoróforo de molécula pequeña a un lugar específico de una proteína donde el conector es solo un par de átomos". Nuevas herramientas como la expansión del código genético, en la que los aminoácidos sintéticos se modifican en proteínas para facilitar el etiquetado, se están moviendo en esta dirección, agrega, pero "están lejos de ser llave en mano".

Centro NatureTech

Tales avances podrían abrir múltiples vías de investigación, especialmente si permiten a los investigadores rastrear varias proteínas, o varios sitios en las proteínas, a la vez. Este año, los investigadores introdujeron una herramienta llamada RESI (resolución mejorada mediante imágenes secuenciales), cuyo objetivo es precisamente eso9. RESI puede etiquetar copias adyacentes de la misma molécula objetivo con diferentes etiquetas, lo que permite a los científicos distinguir entre moléculas que están separadas por menos de un nanómetro. Aunque RESI actualmente solo funciona en moléculas fijas o estacionarias, la combinación de sus hallazgos con los datos de seguimiento de MINFLUX en copias no fijas podría generar hallazgos complementarios sobre la disposición y el movimiento de una proteína.

Ries está interesado en estudiar otras proteínas motoras y, en un experimento complementario compartido en su artículo2, aplicó MINFLUX a la proteína de contracción muscular, la miosina. En 2019, Lavis cofundó una empresa para utilizar el seguimiento de moléculas individuales para el desarrollo de fármacos. Otros científicos han sugerido de todo, desde factores de transcripción y proteínas de unión al ADN hasta cohesina y otros motores moleculares, como objetivos para futuros estudios.

Pero Haley Marks, ingeniera biomédica y científica de proyectos en el Instituto de Nanosistemas de California en la Universidad de California, Los Ángeles, dice que tomará tiempo antes de que MINFLUX se convierta en un sistema "plug-and-play" verdaderamente accesible y asequible. Mientras tanto, sugiere, MINFLUX podría beneficiar a la comunidad en general al contribuir con herramientas virtuales de súper resolución. Estos algoritmos de inteligencia artificial se entrenan en grandes colecciones de imágenes de microscopía para aprender a crear imágenes de súper resolución a partir de las de microscopía convencional. Los datos resultantes, dice Marks, "son mucho más accesibles para las personas que no pueden pagar un microscopio multimillonario".

doi: https://doi.org/10.1038/d41586-023-01906-0

Wolff, JO et al. Ciencia 379, 1004–1010 (2023).